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       2024年7月4日（周四），中國老年保健協會、一味書院主辦的【檢驗月月壇】系列會議第13期“多方法學助力自身抗體實驗室檢測”全國直播會在線上如期召開。大連醫科大學附屬第一醫院李士軍教授擔任大會主席并致辭，遼寧省中醫院張程教授，以及青島市婦女兒童醫院宋金蓮教授擔任本次會議的講者嘉賓。同時大會還邀請了中國中醫科學院廣安門醫院安成教授、哈爾濱醫科大學附屬第一醫院周海舟教授作為本次會議的討論嘉賓。幾位專家主要圍繞“多方法學助力自身抗體實驗室檢測”進行了深入的交流和討論。

大連醫科大學附屬第一醫院  李士軍教授

       開幕致辭環節，李士軍教授對線上各位觀眾的參與表示歡迎，對本次會議的各位講者和主持人表示感謝。李士軍教授指出自身抗體檢測對于自身免疫性疾病的診斷、鑒別診斷、病情評估、治療監測、預后判斷有著非常重要的作用，我國在自身免疫性疾病領域的深耕精作已經取得了矚目的成績，檢驗科已經有能力為自身免疫性疾病的臨床實驗室診斷提供更加全面、完善的檢測方法學和檢測項目，目前自身抗體檢測有多種方法學，每種方法學都有其獨特的應用價值和局限性，今天的主題是多方法學聯合助力自身抗體實驗室檢測，探討不同類型的自身抗體檢測也有不同的檢測策略。而每種方法學都有其獨特的應用價值和局限性，今天的主題是多方法學聯合助力自身抗體實驗室檢測，探討不同類型的自身抗體檢測也有不同的檢測策略。

       學術分享環節，張程教授為大家介紹了常見的自身免疫性疾病以及自身抗體對該疾病診療價值。自身免疫性疾病發病隱匿，表現復雜多樣，這給疾病診斷帶來了極大的困難。而自身抗體的檢測能用于輔助疾病的診斷、鑒別診斷，病情評估，判斷預后等重要作用，在自身免疫性疾病的診療過程起著重要作用。不僅如此，自身抗體檢測還對疾病有著預警作用。如定期檢測CCP，可以有助于提早發現類風濕關節炎。接下來張程教授介紹了臨床中較為常見的自身免疫疾病，如：系統性紅斑狼瘡、抗磷脂綜合征、ANCA相關血管炎、自身免疫性肝病、干燥綜合征。張程教授結合指南深入淺出的介紹了這幾個疾病的臨床癥狀以及相關抗體的臨床應用，令我們受益匪淺。

       緊接著宋金蓮教授進行了題為“多方法學助力自身抗體檢測”的學術報告。宋教授主要從三個方面展開講解，分別是自身抗體的臨床應用和檢測策略、自身抗體檢測的方法學概述和檢測策略推薦。宋教授利用5個臨床病例生動的闡述了自身抗體檢測對疾病診療的重要性，尤其是對于孕產婦和兒童的診療過程中發揮著重要作用。特別是在兒童群體中，系統性紅斑狼瘡的發病癥狀并不典型，往往容易誤診、漏診而耽誤治療。接下來宋教授介紹了目前國內常見的自身抗體檢測方法，著重提到了間接免疫熒光、免疫印跡法、酶聯免疫吸附法、化學發光法，詳細介紹了每種檢測方法的優勢和局限性。最后宋教授以指南為依據，推薦常見自身抗體檢測的策略。宋教授提到對于ANA檢測，推薦用間接免疫熒光法進行ANA的總抗體篩查，同時對于ANA的特異性抗體，需要用免疫印跡法、化學發光法等進行靶抗原確認。由此保證ANA靶抗原的全面覆蓋及單指標檢測的靈敏度，避免漏檢。對于抗dsDNA抗體，不但是系統性紅斑狼瘡的特異性指標，其滴度變化與疾病活動度密切相關，有隨訪監測的價值。所以針對抗dsDNA抗體檢測，可應用間接免疫熒光篩查，同時，ELISA和化學發光法等進行定量監測。對于ANCA是ANCA相關血管炎的重要血清學標志。2017年國際ANCA檢測專家共識推薦IIFT和靶抗原確認平行檢測或IIFT結果陽性，再進行靶抗原確認。

       學術報告后，李士軍教授主持討論環節，并與各位專家圍繞多方法學助力自身抗體實驗室檢測相關內容進行了深入的交流與分享。李教授結合本次會議的主題，以及線上觀眾的提問，提出了三個問題：

問題1：目前自身抗體檢測的方法眾多，其中化學發光自動化程度高，而且定量檢測，相比之下其他方法學還有存在的必要性么？

安成教授：從眾多文獻的報道上來看，其實不同的方法學，在檢測的結果上有互補的作用。因為不同的檢測方法，它檢測的敏感性是完全是不一樣的，特異性也不一樣，就像宋教授介紹的，每種方法學都有獨特的應用價值和局限性。例如間接免疫熒光，是以HEp-2細胞作為檢測基質的經典方法學，HEp-2是包含二百余種自身抗體靶抗原的“天然陣列”，以其作為基質對ANA進行IFA檢測，敏感性高，是目前公認的ANA檢測的金標準，是不能夠被其他方法學取代的。以及在指南中，也是推薦多方法學聯合檢測來降低漏診、誤診。比如：2018年國內發布的ANCA檢測臨床應用專家共識推薦以乙醇固定和甲醛固定的中性粒細胞為基質的IIFT篩查及聯合ELISA確認靶抗原，可有效提高AAV的臨床診斷性能。對于臨床疑似AAV患者，可采用ELISA或CLIA直接檢測靶抗原PR3和MPO。若檢測結果陰性，但臨床仍高度懷疑AAV，應使用其他免疫學方法和/或IIFT-ANCA進行重復檢測。此外，對于IIFT檢測，為了排除ANA的干擾，建議另采用HEp-2細胞+粒細胞（乙醇固定）基質進行輔助檢測。

周海舟教授：周教授同樣認為化學發光法雖然優勢明顯，但不能替代其他方法學。周教授舉例闡述。第一個例子是PLA2R檢測，目前是以間接免疫熒光和酶聯免疫吸附法為主要的檢測方法。間接免疫熒光使用的是細胞和組織為檢測基質，保留了抗原的天然的構象，所以它的敏感度是比較高的。而酶聯免疫吸附法檢測PLA2R特異性較強。目前梅奧診所對于檢測PLA2R給出的建議是間接免疫熒光和酶聯免疫吸附法共同檢測，保證了敏感性的同時，提高特異性。第二個例子是自身免疫性皮膚病的相關檢測，同樣也是間接免疫熒光和四種靶抗原BP180，BP230， Dsg-1和Dsg-3檢測同時進行。間接免疫熒光方法學不但敏感性高，還可以區分是基底膜是表皮側還是真皮側陽性，但如果是表皮側陽性的那個提示呢，就是大皰性天皰瘡，而真皮側陽性，就提示是獲得性大皰性皮表皮松懈癥。而靶抗原檢測特異性較高，兩者結合不但能降低漏檢率，還能明確診斷，同時對臨床用藥選擇有一個很好的提示作用。

問題2：實際工作中，經常會遇到不同方法學結果不一致的情況，對此現象一般如何處理和解決？

安成教授：安教授表示這個問題和第一個問題有一定的相關性。首先不同方法學采用的基質或是抗原是不一樣的。間接免疫熒光檢測ANA使用的是HEp-2細胞為檢測基質，敏感性是很好的。而且不同的核型也提示不同的疾病，對疾病的診療有著重要的作用。免疫印跡法、酶聯免疫吸附法、化學發光法使用的抗原都是經過人工處理純化的，特異性很好。作為檢驗人要把兩者結合應用到臨床中去。

周海舟教授：周教授表示在實際工作中不僅是自身抗體檢測出現這種情況，其他的免疫檢測項目也會出現這種情況。常常是同一個患者在不同的醫院進行檢測，出現檢測結果不一致的情況。針對這種情況我建議在復查時盡量在同一家醫院進行檢測，同時明確檢測方法學，以便更換就診醫院時分析比對。最后周教授提出如果檢測項目有指南推薦的金標準檢測方法，建議出現檢測結果按照金標準方法學出報告。比如雙鏈DNA的檢測，金標準就是使用綠蠅短膜蟲為基質的間接免疫熒光法檢測。所以對于雙鏈DNA的檢測，如果出現不同檢測方法學不一致的情況，建議依據熒光結果來報告。

問題3：自身抗體檢測的室內自制質控品如何操作？又如何評價？

安成教授：自身抗體檢測的質控品比較難以獲得，質控品確實免不了要實驗室自制。我們的自制質控品就是從臨床上發現的一些樣本，然后進行稀釋、評價、保存。自制質控品的評價應該包括重復性驗證、均勻性驗證、穩定性驗證等。以膜條印跡的ENA抗體質控為例，會將收集到的不同陽性樣本混合在一起進行評價，對一些難獲得、低濃度的抗體單獨加入反應池中，防止樣本混合被稀釋而表現陰性。通常在2-8℃短可保存一周，但為了長期使用，需要放在-20℃條件下保存，為了避免反復凍融，可加入甘油，使其在-20℃條件下保持液體狀態，甘油的冰點和它的濃度相關，是一個U字形的關系，-25℃的冰點時，甘油的濃度在50%左右，-40℃的冰點時，甘油的濃度大約在60%左右，隨后隨著甘油濃度增加，冰點反而上升。穩定性可通過破壞實驗來驗證。

周海舟教授：我們的自制質控品也是使用的臨床樣本來制作，選擇無溶血、黃疸、脂血、乳糜及渾濁等樣本，然后進行離心、稀釋。用于間接免疫熒光的質控品一般稀釋到濃度1:320后進行保存。我們對自制質控品的評價同樣包括重復性驗證、均勻性驗證、穩定性驗證這幾個方面。

       最后，李士軍教授感謝一味書院的大力支持，感謝講者和討論嘉賓的精彩分享，感謝線上聽眾的積極參與和關注，感謝一味書院、歐蒙亞太集團及各位在線工作人員的辛勤付出，至此論壇圓滿結束。

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